Pēcepidēmijas laikmetā termins "nukleīnskābju testēšana" ir pazīstams mums visiem, un tas ir kļuvis par mūsu ikdienas sastāvdaļu.
Tātad, vai jūs zināt, kā nukleīnskābju testēšana atklāj vīrusus? Un kā nukleīnskābju testēšana padara neredzamus vīrusus "redzamus"?
01 Kas ir nukleīnskābe
Nukleīnskābe ir vispārīgs termins DNS un RNS.
Nukleīnskābe ir būtiska visas zināmās dzīvības sastāvdaļa uz Zemes. DNS, ko mēs bieži sakām, ir dezoksiribonukleīnskābe. Jaunā koronavīrusa ģenētiskais materiāls ir RNS – ribonukleīnskābe.
Nukleīnskābju amplifikācijas pārbaude
02 Ko tieši nosaka nukleīnskābju pārbaude?
Viela nukleīnskābju noteikšanai ir vīrusa nukleīnskābe.
Jaunais koronavīruss ir vīruss, kas satur tikai RNS, un vīrusa specifiskā RNS secība ir marķieris, kas atšķir vīrusu no citiem patogēniem. Nukleīnskābes noteikšana ir paredzēta, lai noskaidrotu, vai pacienta elpceļu paraugā vai asinīs nav sveša vīrusa nukleīnskābes, lai noteiktu, vai viņš nav inficēts ar jauno koronavīrusu. Lielākajā daļā pašreizējās jaunā koronavīrusa nukleīnskābju noteikšanas tiek izmantota fluorescējošā kvantitatīvā PCR metode, lai pēc reversās transkripcijas pastiprinātu vīrusa RNS mērķa secību ar PCR.
PCR jeb polimerāzes ķēdes reakcija ir molekulārās bioloģijas paņēmiens, ko izmanto specifisku DNS fragmentu pastiprināšanai; tas attiecas uz DNS polimerāzes katalizētu specifisku gēnu reakciju vai DNS sekvenču ātras in vitro amplifikācijas reakciju sauc arī par gēnu in vitro amplifikāciju. Fluorescējošā kvantitatīvā PCR tehnoloģija ir pievienot fluorescējošu reportieru sistēmu PCR reakcijas sistēmai un izmantot fluorescējošā signāla maiņu, lai uzraudzītu PCR procesu reāllaikā, lai realizētu sākotnējās veidnes kvantitatīvo noteikšanu.
Lai noteiktu nukleīnskābi, pirmais solis ir savākt paraugu. Pašlaik visizplatītākā paraugu ņemšanas metode ir: izmantojiet rīkles vai deguna tamponus, lai noslaucītu un savāktu augšējos elpceļus (rīkles vai deguna dobumu); savāktie paraugi tiks stingri aizzīmogoti un pēc tam nosūtīti uz laboratoriju pakāpeniskai pārbaudei.
1. Vīrusu RNS ekstrakcija
Vispirms no parauga tiek ekstrahēta vīrusa RNS. Pievienojiet paraugam nukleīnskābes ekstrakcijas reaģentus, lai iznīcinātu vīrusu un atbrīvotu nukleīnskābi.
2. Vīrusa RNS "reversā transkripcija" par cDNS
Izmantojot reversās transkripcijas tehnoloģiju (RT), vīrusa RNS tiek "apgriezta" īpašā DNS, kuru ir ērtāk noteikt, tas ir, cDNS.
3. cDNS amplifikācija un noteikšana
Faktiski neatkarīgi no tā, vai tas ir rīkles uztriepes, deguna uztriepes vai pat asins paraugu ņemšana, vīrusa saturs paraugā ir salīdzinoši zems pat smagi inficētiem pacientiem (vīrusu slodze ir liela); jo vīrusa daļiņas ir pārāk mazas un paraugu ņemšanas apjoms ir ierobežots, Paraugā esošo vīrusu skaits joprojām ir pārāk mazs nukleīnskābju noteikšanai.
Tāpēc, izmantojot PCR tehnoloģiju, inspektori paraugā pastiprina jaunā koronavīrusa unikālo "paroli" līdz vietai, kur iekārta to var noteikt, lai spriestu, vai tā ir pozitīva infekcija. Viss vīrusa ģenētiskā materiāla sagrābšanas process ir kā zveja. Āķis to identificēs un sagrābs, lai vīrusam nebūtu kur slēpties.
Vienkārši sakot, tā ir cDNS skaita palielināšana, lai cDNS tiktu nepārtraukti replicēta, lai to skaits pieaugtu eksponenciāli.
Standarta PCR process ir sadalīts trīs posmos:
Denaturācija: augstas temperatūras izmantošana, lai atdalītu DNS dubultās virknes. Ūdeņraža saites starp DNS dubultvirknēm tiek pārtrauktas augstā temperatūrā (93 - 98 grādi).
Atkausēšana: pēc tam, kad DNS dubultās virknes ir atdalījušās, temperatūra tiek pazemināta, lai ļautu primeriem saistīties ar vienpavediena DNS.
Pagarinājums: DNS polimerāze sintezē komplementāru virkni gar DNS virkni no saistītā praimera, kad temperatūra tiek pazemināta. Kad pagarināšana ir pabeigta, tiek pabeigts viens cikls un DNS fragmentu skaits dubultojas. Atkārtojiet šīs trīs darbības 25-35 reizes, un DNS fragmentu skaits pieaugs eksponenciāli.
PCR divpavedienu veidne
Kamēr cDNS tiek pastiprināts, komplektā esošās fluorescējošās zondes darbojas vienlaikus. Tas atbrīvos fluorescējošu signālu, un katru reizi, kad cDNS tiek pastiprināts, fluorescējošais signāls nedaudz palielināsies, un PCR detektors var reģistrēt fluorescējošā signāla palielinājuma Ct vērtību.
Ct vērtība ir svarīgs rādītājs, lai novērtētu, vai vīrusa nukleīnskābe ir negatīva vai pozitīva. Jo mazāk sākotnējās DNS, jo vairāk PCR ciklu nepieciešams, lai sasniegtu noteiktu slieksni, un jo augstāka ir Ct vērtība. Un otrādi, jo vairāk sākotnējās DNS, jo zemāka ir Ct vērtība. Sākotnējais DNS daudzums atspoguļo vīrusa RNS daudzumu paraugā, kas savukārt atspoguļo vīrusa daudzumu paraugā. Tāpēc, ja Ct vērtība netiek noteikta vai ir augstāka par noteiktu vērtību, aizdomās turētais pacients tiek novērtēts kā negatīvs; ja tas ir zemāks par šo vērtību, aizdomās turētais pacients tiek novērtēts kā pozitīvs.
PCR reakcijas laikā PCR palīgmateriālu izvēle ir arī viens no svarīgākajiem faktoriem, kas ietekmē nukleīnskābju noteikšanas rezultātus.
