1. Šūnu atveseļošanās
Pēc tam, kad kriokonservētās šūnas tika izņemtas no šķidrā slāpekļa, tās tika atkausētas, pastāvīgi kratot 37 grādu ūdens vannā. Pārnes atkausētās šūnas centrifūgas mēģenē, pievieno iepriekš uzsildītu DMEM pilnu barotni 37 grādos (no kuras liellopu augļa serums ir aptuveni 10 procenti), viegli vienmērīgi izpūtiet, centrifugējiet pie 500 g 2 minūtes un izmetiet supernatantu.
Pievienojiet DMEM pilnu barotni mazgāšanai un izmetiet supernatantu. Pievienojiet DMEM pilnu barotni, viegli samaisiet ar pipeti, pagatavojiet šūnu suspensiju, uzsējiet to Petri trauciņā/kolbā un kultivējiet šūnu inkubatorā, kas satur 5 procentus CO2.
2. Šūnu pāreja
Kad šūnu blīvums sasniedz 80–90 procentus (nepietiekama priekšlaicīga raža, pārāk vēlas šūnas ir sliktā stāvoklī, subkultūra proporcijā 1:2 līdz 1:10 vai vairāk, parasti 1:3 līdz 1:5 šūnu ģenerēšana, tas ir, no šūnu inokulācijas Atdalīšanas un atkārtotas kultivēšanas laikā visa barotne tika izņemta un divas reizes mazgāta ar 1X PBS.
Pievienojiet tripsīnu (piezīme: gremošanas šķīduma daudzums ir vislabākais, lai nosegtu šūnas, un optimālā gremošanas temperatūra ir 37 grādi. Vērojiet šūnas mikroskopā: novērojiet sagremotās šūnas apgrieztā mikroskopā, ja citoplazma ir ievilkta, šūnas vairs nav savienoti kopā. Šķēles, kas norāda, ka šūnas pašlaik ir pareizi sagremotas), sagremot tās un ievietot tos šūnu inkubatorā apmēram 2-3 minūtes.
Pievienojiet atbilstošu daudzumu DMEM pilnas barotnes, lai apturētu tripsinizāciju, pārnesiet uz centrifūgas mēģenē un centrifugējiet ar 500 g 2 minūtes, izmetiet supernatantu, pievienojiet DMEM pilnu barotni mazgāšanai un izmetiet supernatantu.
Pievienojiet DMEM pilno barotni, samaisiet, viegli pipetējot, ar pipeti ievadiet 10 mikrolitrus skaitīšanai un pēc tam turpiniet kultivēt šūnu inkubatorā, kas satur 5 procentus CO2 atbilstoši vajadzīgajam šūnu tilpumam.
3. Šūnu kriokonservēšana
Kad šūnu blīvums sasniedz 80–90 procentus, noņemiet visu barotni un mazgājiet 2 reizes ar 1X PBS. Pievienojiet tripsīnu sagremošanai un ievietojiet šūnu inkubatorā apmēram 2-3 min. Pievienojiet DMEM pilnu barotni, lai apturētu tripsīna gremošanu, pārnesiet uz centrifūgas mēģenē un centrifugējiet ar 500 g 2 minūtes, izmetiet supernatantu, pievienojiet DMEM pilnu barotni mazgāšanai un izmetiet supernatantu. Pievienojiet 1 ml sasaldēšanas šķīduma (90 procenti liellopu augļa seruma, 10 procenti DMSO. Vispārīgi runājot, seruma saturu var noregulēt no 10 procentiem līdz 90 procentiem. Seruma pievienošana saldēšanas šķīdumam, no vienas puses, var nodrošināt šūnas ar barības vielām, Šūnu kriokonservēšanas laikā nodrošiniet necaurlaidīgas aizsargvielas, piemēram, saharozi, albumīnu utt., lai labāk aizsargātu šūnas), ievietojiet to kriokonservācijas mēģenē (mēģenē ir izopropilspirts, lai nodrošinātu temperatūras pazemināšanas ātrumu), nekavējoties ievietojiet to Sasaldē 4 grādu ledusskapī uz 30 minūtēm, pēc tam ievietojiet -20 grādu ledusskapī uz 30 minūtēm un pēc tam ievietojiet -80 grādu ledusskapī uz nakti.
Nākamajā dienā liec šķidrā slāpeklī, var glabāt vismaz divus gadus, un, ja neliek šķidrā slāpeklī, tad trīs mēnešus.
Šūnu kriokonservēšanas un reģenerācijas princips ir: lēna sasaldēšana un atkausēšana, kas ir labvēlīgāka šūnu dzīvotspējas saglabāšanai. Šūnu kriokonservēšana bez jebkāda aizsarglīdzekļa novedīs pie intracelulāro ledus kristālu veidošanās, kas radīs šūnu endogēnus mehāniskus bojājumus, izraisīs intracelulārās vides osmotiskā spiediena, pH, elektrolītu u.c. izmaiņas un pēc tam veicinās šūnu bojāeju.
4. Lietas, kurām jāpievērš uzmanība
(1) Kultūras šķīduma uzsildīšana: sagatavoto pudeli, kurā ir kultūras šķīdums, PBS un tripsīns, ievietojiet 37 grādu ūdens vannā, lai uzsildītu;
(2) Izmantojiet 75% spirta, lai noslaucītu īpaši tīru darbagaldu un rokas, kas ir apstarotas ar ultravioletajiem stariem;
(3) Pareizs lietoto instrumentu izvietojums: nodrošināt pietiekamu darbības telpu, kas ir ne tikai viegli lietojama, bet arī samazina piesārņojumu;
(4) Iededziet spirta lampu: ņemiet vērā, ka liesma nedrīkst būt pārāk maza;
(5) stingra aseptiska darbība;
(6) Mērena pielipušo šūnu gremošana: sagremošanas laiku ietekmē daudzi faktori, piemēram, fermentācijas šķīduma veids, sagatavošanas laiks un kultivēšanas kolbai pievienotais daudzums. Gremošanas procesā uzmanība jāpievērš kultivēto šūnu formas izmaiņām. Kad citoplazma saraujas, ja savienojums kļūst vaļīgs vai ir pazīmes, kas peld gabalos, gremošana nekavējoties jāpārtrauc;
(7) Visām darbībām ar šķērsotajām kamerām jābūt pēc iespējas tuvāk spirta lampas liesmai. Vislabāk vienlaikus ir strādāt tikai ar vienu šūnu, katrai šūnai izmantojot vienu aprīkojuma komplektu. izvairīties no savstarpējas infekcijas;
(8) Pārvadītās šūnas pudeles mute ir jāsterilizē uz spirta lampas katru reizi, kad to atver vai aizver.
