PCR noteikšana
Polimerāzes ķēdes reakcija (PCR) izmanto DNS gabalu kā veidni, un, piedaloties DNS polimerāzei un nukleotīdu substrātam, DNS tiek pastiprināta līdz pietiekamam daudzumam strukturālai un funkcionālai analīzei. PCR noteikšanas metodei ir ārkārtīgi liela nozīme bakteriālo infekcijas slimību klīniskajā ātrajā diagnostikā.
PCR princips tiek izmantots, lai pastiprinātu DNS fragmentu, kas atrodas starp divām zināmām sekvencēm, līdzīgi kā dabiskās DNS replikācijas procesā. Pastiprināmā DNS molekula tiek izmantota kā veidne, un par praimeriem tiek izmantots pāris oligonukleotīdu fragmentu, kas ir komplementāri veidnes 5'galam un 3'galam. DNS polimerāzes iedarbībā tas seko šablonam saskaņā ar daļēji rezervēto replikācijas mehānismu. Ķēdes pagarināšana līdz jaunas DNS sintēzes pabeigšanai, atkārtojiet šo procesu, mērķa DNS fragmentu var pastiprināt.
(PCR) ir metode specifisku DNS fragmentu fermentatīvai sintezēšanai in vitro. Tas sastāv no vairākiem augstas temperatūras denaturācijas, zemas temperatūras atlaidināšanas un piemērotas temperatūras pagarināšanas posmiem. Tādas funkcijas kā augsta jutība, vienkārša darbība un laika taupīšana. To var izmantot ne tikai fundamentālajos pētījumos, piemēram, gēnu izolācijā, klonēšanā un nukleīnskābju sekvenču analīzē, bet arī slimību diagnostikā vai jebkurā vietā, kur ir DNS un RNS. Polimerāzes ķēdes reakcija (saīsināti polimerāzes ķēdes reakcija, PCR) ir pazīstama arī kā bezšūnu molekulārā klonēšana vai specifiska DNS sekvences in vitro primer-virzīta enzīmu amplifikācijas tehnoloģija.
DNS daļēji rezervēta replikācija ir svarīgs bioloģiskās evolūcijas un pārejas veids. Divpavedienu DNS var denaturēt un izkausēt vienā virknē dažādu enzīmu ietekmē. Piedaloties DNS polimerāzei un promotoram, divpavedienu DNS var replicēt tajās pašās divās molekulās saskaņā ar komplementāras bāzes savienošanas principu. Eksperimentos tika atklāts, ka DNS var denaturēties un izkausēt arī augstās temperatūrās, un, pazeminot temperatūru, to var atkal renaturēt dubultšķiedros. Tāpēc, kontrolējot DNS denaturāciju un renaturāciju ar temperatūras izmaiņām un veidojot primerus kā promotorus, DNS polimerāzes un dNTP pievienošana var pabeigt specifisku gēnu replikāciju in vitro.
Vienkāršā lieta ir izmantot īpašu aprīkojumu, izmantot dNTPS, Mg2+, specifiskus primerus, DNS polimerāzi un bufersistēmu, pievienot šablonu, kas ir DNS paraugs in vitro amplifikācijai, un veikt elektroforēzi. Ja to var pastiprināt un pastiprinātā produkta izmērs atbilst mērķa joslai, tas nozīmē, ka primer un veidne ir specifiski un noteikšanas indekss ir pozitīvs.
PCR nukleīnskābju noteikšanas metodes un soļi
Nukleīnskābju testēšanai ir nepieciešami pieci soļi: paraugu ņemšana, parauga saglabāšana, aizturēšana, nukleīnskābju ekstrakcija un datortestēšana.
Nukleīnskābju noteikšana
Vispirms ir jāsavāc cilvēka izdalījumi un jānoslauka deguna dobums vai rīkles aizmugurējā siena un abpusējās rīkles mandeles ar deguna testu vai rīkles testu.
Otrajā solī medicīnas darbinieki paturēja paraugu, iegremdēja testa parauga galvu šūnu konservēšanas šķīdumā un tūlīt pēc astes pārrāvuma uzskrūvēja mēģenes vāciņu.
Trešajā daļā ielieciet paraugu hermētiskā maisiņā, saglabājiet to un savlaicīgi nosūtiet pārbaudei.
Ceturtais solis ir parauga nosūtīšana uz laboratoriju, lai ekstrahētu nukleīnskābi.
Piektajā posmā ekstraktu pakļauj fluorescējošai PCR amplifikācijas reakcijai.
Nepieciešami arī daži palīgmateriāli un instrumenti
Pievienots PCR instruments, PCR caurule, pipetes uzgalis, dziļurbuma plāksne, rezervuārs un reaģenti