PCR tehnoloģijai ir jābūt mākslīgi sintezētiem saprātīgiem primeriem un ekstrahēta parauga DNS, un pēc tam jāveic automātiska termiskā ciklēšana un visbeidzot jāveic produkta identifikācija un analīze. Pašlaik gruntskrāsu projektēšanu un sintēzi var veikt tikai dažos pētniecības institūtos, institūtos un klīnikās ar spēcīgu tehnisko spēku. Lai sāktu darbu, lietojumprogrammai ir jāiegādājas tikai PCR noteikšanas komplekts. PCR automātiskajā termiskajā ciklā ir daudz ietekmējošo faktoru. Dažādiem DNS paraugiem dažādu PCR reakcijā pievienoto komponentu daudzums un temperatūras cikla parametri ir pretrunīgi.
Vairāki galvenie ietekmējošie faktori tagad ir ieviesti šādi.
Viens, temperatūras cikla parametri
PCR automātiskajā termiskajā ciklā vissvarīgākais faktors ir denaturācijas un atkausēšanas temperatūra. Kā parādīts darbības piemērā, denaturācijas, atkvēlināšanas un pagarināšanas apstākļi ir: 94℃60s, 37℃60s, 72℃120s, kopā 25～30 A cikls, pastiprinātais fragments ir 500bp. Šeit katra posma laiks jāaprēķina pēc tam, kad reakcijas maisījums sasniedz vajadzīgo temperatūru. Automātiskajā termociklerā laiks no maisījuma sākotnējās temperatūras līdz vajadzīgajai temperatūrai aizņem 30-60s. Šī aizkaves laika ilgums ir atkarīgs no vairākiem faktoriem, tostarp reakcijas caurules veida, sieniņu biezuma, reakcijas maisījuma tilpuma, siltuma avots (ūdens vanna vai sildīšanas bloks) un temperatūras starpība starp diviem posmiem, kas ir atbilstoši jānodrošina, iestatot termisko ciklu. Pievērsiet uzmanību un apsveriet, un faktiskais mērījums jāveic katram instrumentam.
Vēl viens svarīgs apsvērums attiecībā uz termiskā cikla laiku ir attālums starp diviem gruntskrāsām; jo tālāk attālums, jo ilgāks laiks nepieciešams, lai sintezētu mērķa secību visā garumā. Iepriekš norādītais reakcijas laiks ir balstīts uz optimālo sintēzes garumu 500 bp. Tiek sastādīta mērķa secība. Šeit ir ievads dažādu temperatūru izvēlei.
1. Veidnes denaturācijas temperatūra Denaturācijas temperatūra nosaka temperatūru, kurā PCR reakcijā kūst divpavedienu DNS. Ja denaturācijas temperatūra netiek sasniegta, vienpavedienu DNS veidne netiks ražota un PCR nesāksies. Zema denaturācijas temperatūra nozīmē nepilnīgu denaturāciju, DNS divpavedienu Tas ātri renaturēsies, tādējādi samazinot ražu. Parasti 90-95 ℃. Kad paraugs sasniedz šo temperatūru, tas ātri jāatdzesē līdz atkvēlināšanas temperatūrai. DNS denaturācija aizņem tikai dažas sekundes, un tā nav nepieciešama ilgu laiku; gluži pretēji, jums vajadzētu mēģināt visu iespējamo augstā temperatūrā. Saīsiniet to, lai saglabātu Taq DNS polimerāzes aktivitāti. Maksimālā denaturācijas temperatūra pēc Taq DNS polimerāzes pievienošanas nedrīkst pārsniegt 95°C.
2. Primer atkausēšanas temperatūra Atkausēšanas temperatūra nosaka PCR specifiku un iznākumu; ja temperatūra ir augsta, specifika ir spēcīga, bet, ja temperatūra ir pārāk augsta, praimeru nevar stingri apvienot ar šablonu, un DNS amplifikācijas efektivitāte samazinās; temperatūra ir zema, raža ir augsta, bet pārāk zema var izraisīt grunts un veidnes neatbilstību, Nespecifiski produkti palielinās. Parasti sāciet ar reakcijas stāvokli 37 ℃, iestatiet virkni kontroles reakciju, lai noteiktu optimālo atkausēšanas temperatūru konkrētai reakcijai. To var arī secināt, pamatojoties uz gruntskrāsu (G+C)% saturu, lai saprastu testu. Vispārējā testa sākumpunkts, atkvēlināšanas temperatūra Ta (atlaidināšanas temperatūra) ir par 5℃ zemāka par kušanas temperatūru. Pastiprināšanas grunts TTm (kušanas temperatūra), ko var aprēķināt pēc formulas:
Ta = Tm-5℃ = 4(G{{2}}C){{4}} 2(A+T) -5℃
Starp tiem A, T, G un C attiecīgi apzīmē atbilstošo bāzu skaitu. Piemēram, 20 bāzu gruntim, ja (G+C)% saturs ir 50%, Ta sākumpunktu var iestatīt uz 55°C. Tipiskā primera koncentrācijā (piemēram, 0,2 μmol/L) atkausēšanas reakciju var pabeigt dažu sekunžu laikā, un ilgstoša atkausēšana nav nepieciešama.
3. Praimera pagarinājuma temperatūras izvēle ir atkarīga no Taq DNS polimerāzes optimālās temperatūras. Parasti 70–75 ℃, enzīmu katalizēto nukleotīdu standarta ātrums 72 ℃ temperatūrā var sasniegt 35–100 nukleotīdus sekundē. minūtē. 1kb garumu var pagarināt, un tā ātrums ir atkarīgs no buferšķīduma sastāva, pH vērtības, sāls koncentrācijas un DNS veidnes rakstura. Ja amplificētais fragments ir īsāks par 150 bp, pagarināšanas soli var izlaist, un tas kļūst par divu temperatūras ciklu, jo Taq DNS. Polimerāze ir pietiekama, lai pabeigtu īsu sekvenču sintēzi atkausēšanas temperatūrā. Īsas secības fragmentiem no 100 līdz 300 bp ir efektīvi izmantot ātru un vienkāršu divu temperatūru ciklu. Šajā laikā grunts pagarinājuma temperatūra ir tāda pati kā atkausēšanas temperatūra. DNS fragmentiem, kas lielāki par 1 kb, pagarinājuma laiku var kontrolēt 1 līdz 7 minūšu laikā atkarībā no fragmenta garuma. Tajā pašā laikā PCR buferšķīdumam jāpievieno želatīns vai BSA reaģents, lai Taq DNS polimerāze būtu aktīva un stabila ilgu laiku. Sekss; 15–20% glicerīna palīdz pastiprināt aptuveni 2,5 kb vai garākus DNS fragmentus.
4. Parastās PCR ciklu skaits parasti ir no 25 līdz 40 cikliem. Vispārējā kļūda ir tāda, ka ciklu skaits ir pārāk liels, nespecifiskais fons ir nopietns un sarežģītība palielinās. Protams, reakcijas ciklu skaits ir pārāk mazs, un iznākums ir zems. Tāpēc ir jānodrošina, ka produkts tiek iegūts. Saskaņā ar likmes pieņēmumu ciklu skaits ir jāsamazina līdz minimumam.
Kad amplifikācija ir pabeigta, paraugu atdzesē un uzglabā 4 °C temperatūrā.
2. Primer Primer Design
Lai pastiprinātu veidnes DNS, vispirms jāizstrādā divi oligonukleotīdu praimeri. Tā sauktie praimeri faktiski ir divi oligonukleotīdu fragmenti, kas ir komplementāri pastiprināmajai mērķa DNS secībai. Attālums starp diviem primeriem nosaka pastiprinātā fragmenta garumu. , Divu praimeru 5'gali nosaka pastiprinātā produkta divu 5'galu pozīcijas. Var redzēt, ka primeri ir atslēga PCR pastiprināto fragmentu garuma, novietojuma un rezultātu noteikšanai, un svarīgāks ir primer dizains.
Praimera izstrādei nepieciešamais nosacījums ir tas, ka ir jāzina mērķa DNS sekvence, kas ir komplementāra primeram. Secība starp diviem primeriem ne vienmēr ir skaidra. Abas zināmās sekvences parasti ir 15-20 bāzes, kuras var sintezēt ar DNS sintezatoru. Atbilstoši diviem savstarpēji papildinošiem gruntskrāsām, primeru projektēšanā parasti tiek ievēroti šādi principi:
1. Praimera garums tiek aprēķināts saskaņā ar statistiku, un varbūtība, ka cilvēka genomā var parādīties apmēram 17 bāzu oligonukleotīdu secība, ir vienreizēja. Tāpēc primera garums parasti nav mazāks par 16 nukleotīdiem, bet lielākais - ne vairāk kā 30 nukleotīdi, un labākais garums ir 20–24 nukleotīdi. Šādi īsi oligonukleotīdi neveidos stabilu hibrīdu polimerizācijas temperatūrā (pārsniedzot 72°C). Dažreiz tas var būt pie 5' Pievienojiet sekvences, kas nav komplementāras veidnei beigās, piemēram, restrikcijas enzīmu vietas vai promotorus, lai pabeigtu gēnu klonēšanu un citas īpašas vajadzības; primer 5'beigas biotīna etiķete vai fluorescējoša etiķete var tikt izmantota dažādiem mērķiem, piemēram, mikrobu noteikšanai.
Dažreiz gruntējums nedarbojas' iemesls nav zināms, varat pārvietot pozīciju, lai to atrisinātu.
2. (G+C)% gruntskrāsu sastāvam jābūt vienmērīgam un jācenšas izvairīties no tā paša bāzes polimēra satura. (G+C)% saturam abos primeros ir jābūt pēc iespējas līdzīgākam, zināmajā pastiprinātajā fragmentā (G+C) % saturam jābūt tuvu pastiprināmajam fragmentam, parasti 40% līdz 60% ir labāk.
3. Gruntējuma iekšpusē jāizvairās no acīmredzamu sekundāro struktūru, īpaši matadata struktūru, veidošanās. Piemēram:
4. Starp primeriem nedrīkst būt komplementācijas starp abiem praimeriem, īpaši primera 3'galā. Pat ja no tā nevar izvairīties, 3'beigas komplementārā bāze nedrīkst būt lielāka par 2 bāzēm, pretējā gadījumā ir viegli izveidot"primer dimer" Vai"Primer dimer" (Primer dimer). Tā sauktais primer dimērs būtībā ir divpavedienu DNS fragments, kas veidojas, pagarinot vienu praimeru uz otras primera sekvences DNS polimerāzes iedarbībā. , Ir izplatīts PCR blakusprodukts un dažreiz pat kļūst par galveno produktu.
Turklāt izvairieties no homologām sekvencēm starp diviem primeriem, īpaši oligonukleotīdu fragmentiem ar vairāk nekā 6 secīgām identiskām bāzēm, pretējā gadījumā abi praimeri konkurēs viens ar otru par vienu un to pašu veidnes vietu; līdzīgi primeriem un amplificējamajai mērķa DNS vai citām parauga DNS sekvencēm nevar būt homologas sekvences, kas garākas par 6 bāzēm. Pretējā gadījumā praimeri saistīsies ar citām vietām, samazinot specifisko pastiprinājumu un palielinot nespecifisko pastiprinājumu.
5. Primer 3' gala pāra DNS polimerāze pievieno vienu nukleotīdu praimera 3' galam. Tāpēc, lai nodrošinātu efektīvu PCR amplifikāciju, prasībām par 5-6 bāzēm no 3'gala praimera un mērķa DNS jābūt precīzām un stingrām. .
To, vai gruntējuma dizains ir saprātīgs, var pārbaudīt, izmantojot datoru meklēšanu, izmantojot programmatūru PCRDESN un programmatūru American PRIMER.
Mākslīgi sintezētus oligonukleotīdus vēlams attīrīt ar hromatogrāfiju (hromatogrāfiju) vai PAGE, lai noņemtu piemaisījumus, piemēram, īsās ķēdes, kas nav sintezētas pilnā garumā. Attīrīti grunti, kas uzglabāti 25% acetonitrila šķīdumā 4°C temperatūrā, var novērst mikroorganismu rašanos Normālos apstākļos neizmantotie grunti jāuzglabā ledusskapī -20°C temperatūrā. Primerus var uzglabāt šķidrumā 6 mēnešus, un pēc liofilizācijas var uzglabāt 1 līdz 2 gadus.